首页-│天富娱乐注册│天富娱乐登录官网-用于RNA递送的脂质和高分子材料(主管:QQ66306964 主管:skype live:.cid.6c7b79dae5ec9830)基于RNA的疗法在治疗多种疾病，特别是“不可成药靶点”相关疾病方面已经引起了人们广泛的关注。在过去的数十年中，已经有多款ASO及siRNA药物被批准应用于临床治疗如黄斑变性、脊髓性肌萎缩、高胆固醇血症和 TTR 介导的淀粉样变性等多种疾病 [1-4]。新冠爆发以来，分别由Pfizer/BioNTech及Moderna开发的BNT162b2和mRNA-1273 mRNA新冠疫苗被批准用于临床，并显示出较高的安全性及有效性[5]。除病毒疫苗外，mRNA在肿瘤疫苗，治疗性蛋白体内表达，基因编辑等领域也具有广泛的应用前景 [6-8]。

　　目前，RNA治疗面临的主要难点仍然是如何将完整的RNA成功递送进细胞内。RNA是一种带负电的疏水大分子，很难透过带负电的细胞膜进入胞内。其次，RNA具有酶不稳定性，在体外及体内都极易被RNA酶降解 [9]。病毒载体虽然具有较高的核酸递送效率，但容易引起机体不良免疫反应 [10]。因此，基于非病毒递送载体已成为一种有吸引力的替代方案。到目前为止，已经有多种递送材料如脂质、脂质类似物、多聚物、蛋白多肽等被成功开发应用于不同类型的RNA递送 [11, 12]。

　　RNA是带负电的亲水性大分子，很难透过细胞膜。借助于递送载体对RNA进行包载递送，既可以保护RNA不被循环系统中酶的降解，又可以将RNA递送至细胞内[13]。

　　纳米离子在循环系统中需要逃避免疫细胞的吞噬，穿越血管内皮细胞，并穿过细胞外基质才能接近靶细胞 [13]。粒度≤100 nm的脂质纳米粒在循环系统中逃避吞噬细胞吞噬的效率更高，体循环半衰期相对更长 [14, 15]。也更容易穿越血管内皮细胞，进入细胞外基质，到达靶细胞 [16]。人体肝脏部位的血管内皮间隙在100-110 nm之间。因此，应用于人体的纳米药物载体最合适的尺寸是100 nm左右，最好不超过200 nm [16, 17]。

　　细胞膜和溶酶体是RNA纳米递送面临的第二道屏障。当纳米颗粒通过胞吞和胞饮途径进入细胞后，纳米颗粒需要在内体-溶酶体形成的期完成溶酶体逃逸，否则会被溶酶体降解 [18, 19]。纳米颗粒的内体-溶酶体逃逸效率是影响核酸递送载体递送效率的限制性因素 [20]。以递送效率相对较高LNP为例，被细胞吞噬的LNP仅有1-2%可成功实现溶酶体逃逸[21]。

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　　纳米粒实现溶酶体逃逸机制主要有两种。一是质子海绵效应，质子海绵效应通常是PEI，PAMAM等阳离子高分子材料的溶酶体逃逸机制。质子海绵效应是指阳离子聚合物在溶酶体内发生质子化，质子不断被泵入内体/溶酶体。为了保持电解质平衡，氯离子也大量泵入内体/溶酶体。 这导致内体/溶酶体渗透压变高，最终导致内体/溶酶体破裂，释放聚合物载体 [22]。纳米颗粒实现溶酶体逃逸的第二种机制是膜融合，脂质材料可通过脂质-内涵体膜融合实现内体-溶酶体逃逸的常见递送载体[23]。脂质与内体-溶酶体膜融合后可导致内体-溶酶体膜不稳定，使脂质材料从内体-溶酶体的孔洞中逃逸，从而提高核酸递送效率 [22, 24]。

　　Bangham 于1965年首次报道人工合成脂质体的方法 [25]。脂质体是一种人工膜，是由磷脂双分子层组成的球形体，直径在25-1000 nm不等。脂质体具有和细胞膜融合的特点，并具有较高的安全性。因此，脂质体被认为是一种理想的药物递送载体 [26]。由于核酸是一种带负电的疏水大分子，中性或带负电荷的电脂质体对核酸的装载及递送效率不高。1987年Felgner首次报道使用阳离子脂质体（DOTMA）递送DNA，阳离子脂质体的应用极大的提高了核酸的装载及递送效率 [27]。1989年Malone 等人首次报道了以DOTMA: DOPE=1:1（mol : mol）制备的脂质体(lipofectin)用于转染luciferase mRNA，实验结果表明lipofectin具有较好的体外转染效果 [28]。此后，以DOTMA、DOPE、胆固醇为原料制备的脂质体也被开发为商业化转染试剂，广泛应用于基础研究中[29]。

　　虽然阳离子脂质体如lipofectin在体外细胞核酸转染中具有较高的递送效率，但是阳离子脂质体在体内核酸递送方面并没有体现出与体外一样的效果。阳离子脂质材料有利于增加细胞对脂质体的摄取，但是阳离子脂质体注入体内后也极易与体循环系统内带负电的血浆蛋白、血细胞等产生非特异性结合，导致脂质体聚集，并快速的被清除出体外 [30]。据报道，阳离子脂质体在体内的半衰期仅有15 min [31]。此外，阳离子脂质体在注射到体内后可激活NF-κB、ROS、MAPK、caspases等炎症、凋亡通路，对机体产生毒性 [32]。递送效率及安全性限制了阳离子脂质体体内核酸递送方面的应用。

　　为了增加核酸的装载和递送效率，研究者们开发出一种称为可电离脂质体的脂质材料，并将制剂形式原来的脂质体改进为包封效率更高、制剂过程更加便捷高效的LNP [33]。可电离脂质一般具有一个叔胺头部，两条碳链尾巴。叔胺头部作用是使脂质在酸性条件下电离，脂质碳链尾巴则是提供强疏水性，以促进纳米颗粒形成过程中掺入颗粒内 [34]。

　　可电离脂质是指pKa在6-7之间的脂质分子，当pH小于pKa时，可电离脂质带正电。当pH接近pKa时，可电离脂质呈现中性电荷 [35]。因此，可电离脂质可以在酸性缓冲溶液条件下完成对核酸的装载，核酸装载完成后使用中性缓冲液稀释成品LNP，再经超滤去除有机溶剂和酸性缓冲液，使产品最终在中性pH条件下存储 [36] Figure 1。由于动物体循环系统pH接近中性，可电离脂质在体循环系统中电荷也呈中性。与阳离子脂质相比，中性脂质与血浆蛋白或血细胞之间的非特异性结合显著减少，半衰期（5-6h）与生物相容性也得到较大的提高 [8, 31]。当可电离脂质LNP被细胞摄取后，陷于内涵体的脂质在内涵体pH条件下（pH 5-6）发生电离并带正电，带正电的脂质容易与内体-溶酶体膜融合，使脂质体逃逸至胞浆，解离并释放核酸 [35, 36] Figure 2。可电离脂质的设计原则基于血液循环系统与内体-溶酶体pH差异，实现了脂质在内循环系统与胞内电荷的巧妙转变，既减小了载体毒性，又提高了体内核酸递送效率 [37]。

　　DODAP和DODMA是第一个被用于包载RNA的可电离脂质 [31]，DODAP和DODMA分别由阳离子脂质DOTAP和DOTAM改进得到 Figure 3 [38]。有研究者研究了脂质分子头部、Linker、和尾部对分子假设模型认为，脂质分子头部截面积和尾部面积相似的情况下，在脂质纳米形成的过程中倾向于形成层状（bilayers）。如果脂质分子尾部截面积大于尾部截面积，在脂质纳米形成过程中倾向于形成使膜不稳定的HII 反相胶束型Figure 8.9 [34, 39]。反相胶束型具有更好的细胞转染效果。脂质分子尾部的饱和度对脂质纳米HII反相胶束形成过程有影响，由 DODMA改进得到的DLinDMA比原型分子增加了两个不饱和双键 Figure 3，相变温度变低，显示出更佳的HII反相胶束形成能力和更佳的膜融合能力 [38]。在研究支链饱和度对脂质分子转染效率影响的同时，研究者对脂质分子的头部和Linker结构和结构也进行了一系列的改进优化。Muthusamy 等人于2012年合成出递送效率及安全性都较好的DLin-MC3-DMA，Dlin-MC3-DMA头部linker采用酯键替换了醚键，使Dlin-MC3-DMA在体内可降解。Dlin-MC3-DMA的发明这被认为是可电离脂质分子开发史上的里程碑事件 [40, 41]。

　　从脂质分子改进结构可以历史看出，分子结构的微小改变对可电离脂质体的核酸装载效率影响较大 [40, 41]。在后续的研究中，为了增加可电离脂质分子的可降解性，在基于MC3的基础上，Martin等人在MC支链上继续引入酯键，并对引入酯键的位置进行变换 Figure 4。研究表面，酯键靠近脂质分子头部会影响脂质分子的pKa，酯键靠近尾部对脂质分子的pKa影响则相对较小。酯键在双链中8碳位置的L319在体内实验中显示出与MC3相似的递送效果，且具有好的降解毒性及更快的代谢速度。在非灵长类动物食蟹猴体内静脉给药后，使用LC-MS/MS 检测血浆中的L319血浆浓度，结果表明L319在给药4小时后血浆浓度可下降100倍，24小时血浆浓度下降3000倍，48小时已经无法检测到 [42]。

　　Khalid A.等人研究了脂质支链类型，即branched支链和直链支链对脂质分子RNA装载及递送效果的影响。研究发现，具有branched支链的脂质分支比直链脂质分子具有更高的mRNA递送效果 [43]。由Khalid A.等人开发的branched支链脂质分子306iOFigure 5对 luciferase mRNA具有91%的装载效率，体内递送效率分别是是MC3、C12-200处方的3倍和20倍 [44]。

　　Dan Peer实验室对可电离脂质分子的Linker和支链类型进行了一系列的设计研究，在Linker上添加了肼、羟胺和乙醇胺等官能团，并对支链进行改造。在MC3的结构基础上，对Linker位置使用N连接头部和尾部 Figure 6。改造后磷脂分子用于递送可影响细胞活性的PLK1siRNA，结果显示其效果优于比MC3 [45]。 但其设计的Branched支链却没有体现出更优的siRNA递送效率。

　　PEG脂质在LNP中可影响LNP的粒径、电位，并减少纳米粒的聚合现象，增加LNP的体内循环时间。PEG在延长LNP体循环时间的同时，还会阻碍靶细胞对LNP的摄取，不利于细胞转染 [46]。在LNP的溶酶体逃逸步骤，PEG也将对LNP与溶酶体之间的膜融合产生负面影响，降低核酸递送效率 [47]。为了克服PEG脂质的这些缺点，LNP中的使用的PEG脂质被设计成可从纳米粒中解离的PEG脂质，解离时间由其亲脂性尾部碳链长度决定 [48-50]。

　　PEG化脂质是通过其亲脂性尾部插入LNP磷脂层，使PEG锚定于LNP表面。锚定的PEG在体循环过程中可发生解离、脱落， LNP表面的PEG脱落后有利于细胞对LNP的摄取。PEG锚定在LNP中的强度由PEG化脂质的亲脂性尾部长度决定。PEG亲脂性尾部越长，锚定强度越大。目前市面上有亲脂性尾部长度分别为18碳、16碳、14碳等多种规格的PEG化脂质Figure7 [49]。研究表面，使用亲脂性尾部碳链长度为14碳的PEG化脂质可使LNP具有较为合适的循环时间以及最佳的递送效果 [48, 49]。mRNA-1273 和 BNT162b2 mRNA SARS-CoV-2 疫苗LNP处方采用的PEG化脂质亲脂性尾部碳链长度分别为13碳和14碳，分子量约为2500 [51]。

　　胆固醇可填充脂质双分子层的间隙，调节膜的完整性和刚性，增加LNP的稳定性 [51]。也有一些研究者认为胆固醇是LNP肝靶向原因。因为肝脏部位具有较多的低密度脂蛋白受体，是参与胆固醇代谢的重要受体 [52]。

　　DSPC与DOPE都是LNP中常用的助磷脂，DSPC与DOPE具有不同的P值（p=两亲性磷脂体积(V)与头部面积(a)及临界尾长(L)的比值，P=V/aL）[53] Figure 8，DSPC的P值在1/2到1之间，呈圆柱形，形成的脂质体是层状相，这种类型的脂质体具有较高的稳定性。DOPE的P值大于1，呈倒锥形，形成的脂质是倒六角形状 [53, 54]。Safinya 及其同事使用同步加速器小角 X 射线散射 (SAXS)研究了DOPE结构与其转染效果的关系。研究发现，DOPE可使核酸-脂质复合物的膜结构由多层结构向倒六边形结构转变 Figure9。倒六边形结构很容易与阴离子膜结合，促进脂质体膜与阴离子膜融合，加速核酸释放 Figure 10 [22, 24]。

　　助磷脂对脂质体的核酸递送效果的影响也可以依据相变温度来判断，相变温度是指脂质由稳定的层状相（lamellar phase）到不太稳定的六方相（hexagonal phase）转变的临界温度，结构为六方相的脂质易与内体-溶酶体膜融合，促进脂质的内涵体逃逸和解离 [55]。 DSPC相变温度约为53℃，DOPE的相变温度为-16℃ [56]，因此，DOPE理论上比DSPC具有更好的核酸递送效果。实验验证发现，DOPE对mRNA有更高的递送效率 [57]，DSPC对siRNA有更高的递送效率 [58]。FDA批准的第一个siRNA LNP药物onpattro使用的助磷脂是DSPC，后续mRNA-1273及BNT162b2新冠疫苗均采用的是DSPC，可能是因为DSPC已经是被批准临床使用的药用辅料。

　　有研究表明，DSPC或DOPE不仅可以影响LNP的核酸递送效果，还可影响LNP在体内的分布。以DSPC为助磷脂制备的LNP不仅可以靶向肝脏，还可以靶向脾脏。而以DOPE为助磷脂制备的LNP主要靶向肝脏。因此，选择DSPC作为助磷脂有可能有利于增强LNP mRNA疫苗的效果 [59]。

　　之前一般认为，LNP主要靶向肝脏，2020年，MIT Daniel J团队发现 LNP的电荷可以影响LNP的组织分布。以MC3和C12两种可电离脂质为原料制备LNP为例，在原处方中（MC3/C12:DSPC:CHOL:PEG）加入阳离子脂质DOTAP或阴离子脂质18PA可使LNP由原来的肝靶向变为肺靶向或脾脏靶向Figure 11[60, 61]。

　　电荷可逆脂质衍生物（DOP-DEDA）Figure 12是由日本精细化工发明的一种与可电离脂质类似，具有可电离功能的新型脂质。传统可电离脂质体由其头部的叔胺基团在不同的pH条件下发生电离，产生不同电荷。而由日本精细化工发明的电荷可逆脂质衍生物不含叔胺基团头部，其头部为磷酸根和氨基。在不同pH条件下，磷酸根和氨基发生可逆的电离，使脂质在不同的pH条件下呈现不同的电荷。

　　与传统的可电离脂质体相比，DOP-DEDA合成步骤简单，价格低廉。DOP-DEDA制备LNP的条件及步骤与传统可电离脂质体一致。在安全性方面，DOP-DEDA在生理条件下没有溶血性，具有较高的安全性。此外，以DOP-DEDA、DSPC、Chol为处方制备LNP可以不需要加入PEG化脂质，且LNP成品不会因为PEG化脂质的缺失发生聚集。考虑到PEG在mRNA LNP疫苗中可引起个体过敏反应 [62]，无PEG的DOP-DEDA LNP理论上具有一定的优势 [63]。

　　PEI是体外核酸递送中使用的最广泛的高分子聚合物之一，但PEI的毒性较大，限制了其体内应用 [72]。后来的一些研究者将PEI和PEG聚合，开发出PEI-PEG，在一定程度上减弱了PEI的毒性 [72]。从成药性考虑，PEI电荷密度高毒性大，无法代谢，这些确定使以PEI为载体的递送系统很难成药。Home -ClinicalTrials.gov有一项使用 20 kd 的PEI作为载体系统进行DNA递送的一期临床实验记录，该临床实验于2019年开始招募患者，至今尚未见任何进展报（clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT04049864?cond=Polyethylenimine&draw=2&ra聚乳酸-羟基乙酸共聚物nk=3）。

　　聚乳酸（PLA），聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）是由乳酸和羟基乙酸单体聚合而成。是一种可安全，在生物体降解，且已经被FDA批准可用于临床的高分子材料 [72, 73]。PLA及PLGA可以与PEG聚合，形成PEG-PLA或PEG-PLGA纳米胶束，研究主要集中在对小分子的装载及递送方面 [74]。以PLGA或PLA为递送载体递送RNA效果不佳，将PLGA或PLA以及其他递送载体如阳离子脂质进行整合，制备为hybrid-nanoparticles，具有更好的RNA递送效果。该部分内容将在hybrid-nanoparticles章节进行介绍。

　　PBAE是一种单链，可降解的高分子聚合物，以伯胺或仲胺与二丙烯酸酯为原料合成，Chiellini于1983年首次报道PBAE [75]。MIT的Langer团队于2000年首次将PBAE用于DNA质粒递送 [76]。PBAE的胺基带正电，可与核酸中带负电的磷酸基团发生静电相互作用，形成高分子-核酸复合物。PBAE溶解性好，pKa约为5.5-7.4，有较好的溶酶体逃逸能力，在生物体内可降解 [77]。PBAE还可以使用多种给药方式，如肌肉注射、雾化给药、微针等 [78-80]。新博2PBAE除作为单独的核酸递送载体外，还可与DOPE、Chol、PEG通过微流控的方法制备复合纳米粒，该复合纳米粒尾静脉注射给药具有肺部靶向的作用 [81]。

　　高分子的结构可影响核酸递送效率。与线性高分子相比，支链高分子有更好的核酸递送效果 [77]。经研究验证，研究者开发出转染效率更高的支链PBAE，被称为HBAE。与PBAE相比，HBAE胺基密度更高，因此核酸装载效率更高 [82]。此外，HBAE-核酸复合物比PBAE-核酸复合物有更稳定的胶体稳定性 [83]。爱尔兰都柏林大学Wenxin Wang 课题组对HBAE合成及利用开展了较多的研究工作 [84, 85]。

　　壳聚糖是一种来源于自然界的高分子材料。壳聚糖因分子中含有胺基而呈正电，可通过静电相互作用装载核酸 [86]。Enrique等人报道了一种以壳聚糖-透明质酸为原料制备的mRNA递送系统。方法简要步骤为：将mRNA溶液在搅拌状态下滴加至壳聚糖溶液中，10 min后将mRNA/壳聚糖复合物加入同等体积的透明质酸溶液中，继续搅拌30 min [87]。壳聚糖作为核酸递送的一个劣势是其溶解性差，递送效率不高。通过化学修饰方法改造壳聚糖，增加其溶解性，有助于提高壳聚糖核酸递送载体的递送效率。

　　Hybrid nanoparticles由多种材料构成，如脂质，高分子聚合物，脂质化PEG。目前，国内新冠疫苗开发厂商中斯微生物采用的LPP由阳性高分子聚合物、脂质、PEG化脂质构成。根据其公开发表的论文，LPP的合成步骤是先利用阳性高分子聚合物对mRNA进行包载，然后将高分子mRNA复合物与脂质及PEG化脂质混合，最终形成一个核-壳结构的纳米颗粒LPP [88]。根据开发者公开报道，LPP具有较好的稳定性，可冻干，商品期与LNP相比更长。斯微生物CTO兼联合创始人沈海法具有多年的核-壳结构纳米材料研发经验，其以往公开发表的学术论文中阳性核酸载体采用的是PBAE或者鱼精蛋白，脂质体是使用的49% EDOPC， 49% DOPE ，2% DSPE-PEG。制作步骤是先制备脂质薄膜，在薄膜水化过程中加入PBAE-mRNA或鱼精蛋白-mRNA复合物 [89]。核壳结构Hybrid nanoparticles相较于LNP而言制备步骤稍微复杂，在质量控制方面可能需要考虑的步骤更多。其优点是可以规避LNP相关专利。如果LPP中多聚物的安全性及核酸装载效率问题得到解决，工艺成熟稳定。LPP未尝不是一个好的选择。

　　PLGA是由乳酸和羟基乙酸单体聚合而成，是一种已经在临床上批准使用的高分子聚合物首页-│天富娱乐注册│天富娱乐登录官网-，常用于制备小分子药物微球或纳米胶束 [90, 91]。由于PLGA和核酸都带有负电荷，PLGA对核酸装载效率并不高 [92]。为了解决PLGA对核酸装载效率较低的问题，采用PLGA和脂质制备hybrid-NPs是一种有效的方法。中国科学院国家纳米中心蒋兴宇教授报道了一种以PLGA、DOTAP、DPPC、DSPE-PEG脂质为原料制备，使用微流控制备的核-壳纳米，用于小分子及siRNA的共包载。该微流控芯片由三个阶段组成，第一阶段有三个入口和直通道，第一个是亲水试剂如核酸和小分子通道（水相），第二个旁通道是PLGA&DOTAP通道（油相）。第二个阶段是两根通水的通道（水相）。第三个通道是一根注入DPPC、DSPE-PEG 和胆固醇的螺旋通道（乙醇相）。在第一阶段中，亲水的小分子和siRNA被PLGA包裹， PLGA形成核结构后，DOTAP会与PLGA核表面形成反向胶束。由于DOTAP带正电，可以保证siRNA被封装与水相。最后阶段，脂质(DPPC、DSPE-PEG、 cholesterol)覆盖在纳米粒表面，增加纳米颗粒的稳定性 [93]。这个方法对siRNA和小分子药物的包装率都达到90%以上，纳米颗粒成品粒度约130-140nm，PDI为0.222 [94]。该微流控制备核壳结构纳米粒的方法在后期没有更进一步的报道。这个方法优点是PLGA和脂质材料都是安全性较高的材料，缺点是制备过程中使用到DMF溶剂，DMF溶剂可能会造成溶剂残留。如果能解决溶剂残留及工艺稳定性问题，PLGA-脂质复合纳米将具有较高的临床转化价值。

　　RNA药物作为一个新兴的药物研发领域为新药研发提供无限可能。RNA递送载体开发是RNA药物研发应用的限制因素。虽然基础研究发现多种合成或天然的高分子、蛋白、多聚物具有包载、递送核酸的潜力。但有效性，安全性等问题制约了其应用。目前，LNP仍然是最简便、高效、安全的核酸递送载体。回顾LNP的发展历史，LNP的开发应用经历了30余年的研发历程。可电离脂质分子的开发，LNP处方配比，LNP制备仪器的研发，都是几十年技术积累的硕果。LNP mRNA疫苗及药物的临床应用产生了大量积极的安全性和有效性数据。为LNP药物的开发提供了很好的参考资料。

　　在未来的研究中，RNA药物将不仅仅局限于疫苗，在肿瘤免疫治疗，蛋白替换治疗，不可成药靶点相关疾病方向都具有广阔的开发前景和价值。开发新的，安全、高效的递送材料对RNA药物开发意义重大，且任重道远。新博2娱乐注册